Для усиления обороны границ Российской империи от набегов кочевников Неплюев предложил императрице Елизавете Петровне сформировать Оренбургское нерегулярное войско. В своём докладе он обосновал это тем, что казаки лучше приспособлены к службе в степных условиях и борьбе с киргиз-кайсаками (казахами), а их содержание обходилось казне дешевле, чем регулярных армейских частей.
24 мая 1748 года Военная коллегия Сената издала указ об организации Оренбургского казачьего войска. По инициативе Неплюева в его состав вошли:
- Алексеевские и Сергиевские казаки,
- казаки Уфимской и Исетской провинций,
- Оренбургский нерегулярный корпус,
- казаки города Оренбурга и крепостей (Табынской, Нагайбацкой, Красноуфимской и др.).
В 1758 году Оренбургское казачье войско было официально приравнено в правах к Донскому. Его центром стал Оренбург, а управление осуществлялось войсковым атаманом под контролем губернатора.
Деятельность Ивана Ивановича Неплюева в Оренбургском крае имела огромное значение для укрепления юго-восточных границ России. Благодаря его усилиям Оренбургское казачье войско стало надёжным щитом империи, а система крепостей и грамотное управление обеспечили стабильность в регионе.
В честь Неплюева названы улицы в Оренбурге и других городах, а его вклад в развитие региона до сих пор изучается историками.